Классификация питательных сред микробиология

Общая характеристика питательных сред. Классификация питательных сред

Известно значительное количество питательных сред, используемых для культивирования и поддержания (сохранения) микроорганизмов. Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях. Еще в 1930 году их было классифицировано не менее двух тысяч наименований, но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, относительно невелико, а их композиции создаются на определенных общих принципах. Для размножения любых бактерий необходимо обеспечить подходящее биофизическое окружение и биохимические питательные компоненты.

Любая питательная среда должна соответствовать следующим требованиям: содержать все необходимые для роста питательные вещества в легко усвояемой форме; иметь оптимальную влажность, вязкость, рН, быть изотоничной, сбалансированной с высокой буферной емкостью и, по возможности, прозрачной. Для роста автотрофных бактерий потребности в питательных веществах довольно просты: вода, двуокись углерода и соответствующие неорганические соли. Например, бактерии рода Nitrobacter ассимилируют СО2 и получают энергию путем окисления нитритов в нитраты. Гетеротрофные бактерии получают энергию в результате окисления (диссимиляции) восстановленных углеродных соединений.

Гетеротрофные бактерии используют органические соединения в двух целях: 1) в качестве источника энергии; при этом органическое вещество окисляется или расщепляется с высвобождением энергии и образованием ряда конечных продуктов типа СО2, органических кислот и др; 2) в качестве субстратов, ассимилируемых непосредственно с образованием клеточных компонентов или для их синтеза в реакциях, требующих затрат энергии. Так, E.coli способна к росту на простой среде, содержащей только глюкозу и неорганические соли. Молочнокислые же бактерии растут на сложных средах, содержащих в качестве добавок ряд органических соединений (витамины, аминокислоты и др.), которые клетки не в состоянии синтезировать самостоятельно. Такие соединения называются факторами роста. Организмы, которые нуждаются в их добавлении к ростовой среде, называются ауксотрофными по соответствующим соединениям. Другая группа организмов, способная к росту на простых средах, содержащих источник углерода и энергии, а также набор основных биогенных элементов, получила название прототрофных. Следует учитывать и то, что в природе встречаются бактерии, которые способны размножаться в местах с низким пищевым потоком углерода – до 0,1 мг/л в день. Они получили название олиготрорфных,противоположную группу для них составляют бактерии копиотрофные– способные к росту на богатых пищевых субстратах.

Выбор питательной среды зависит в значительной степени от целей эксперимента, а существующая классификация питательных сред учитывает характеристику их следующих особенностей.

По составу питательные среды делятся на натуральныеи синтетические. Натуральными называют среды, которые состоят из продуктов растительного или животного происхождения, имеющих неопределенный химический состав. Примерами питательных сред такого типа являются среды, представляющие собой смесь продуктов распада белков (казеина, мышц млекопитающих), образующихся при их гидролизе. Кислотный (НСl) гидролиз белков используется для приготовления полных гидролизатов. Действие ферментов типа трипсина, панкреатина, папаина, приводит лишь к частичному (неполному) гидролизу белков, в результате чего образуются пептоны. Как правило, на пептонных питательных средах микроорганизмы растут лучше, чем на питательных средах, приготовленных из полных гидролизатов или смесей аминокислот. При ферментативном гидролизе, вероятно, сохраняются лабильные факторы роста. Кроме того, многие микроорганизмы лучше размножаются на средах, содержащих небольшие пептиды, потому что их они могут усваивать непосредственно, а отсутствующие аминокислоты – нет. Обычно в составе такой среды ферментативный гидролизат белка обеспечивает потребность в таких источниках азота, как аминокислоты, углеводы (глюкоза), используется как источник углерода и энергии, соли удовлетворяют потребности бактерий в неорганических ионах, а дрожжевой экстракт обеспечивает потребности в витаминах. К питательным средам неопределенного состава можно отнести и среды, полученные на основе растительного сырья: картофельный агар, томатный агар, отвары злаков, дрожжей, пивное сусло, настои сена и соломы и др. Основное назначение таких питательных сред – выделение, культивирование, получение биомассы и поддержание культур микроорганизмов.

К числу сред неопределенного состава относят и среды полусинтетические. В такую среду вносят известные соединения как явно необходимые; а также добавляют небольшое количество дрожжевого или кукурузного экстракта (или любого другого природного продукта) для обеспечения неизвестных потребностей роста. Такие среды часто используются в случае промышленного культивирования биологических объектов для получения продуктов метаболизма.

Синтетические среды– это среды определенного состава, представленные чистыми химическими соединениями, взятыми в точно указанных концентрациях и соотношениях отдельных элементов. Обязательными компонентами таких сред являются неорганические соединения (соли) и углерод- и азотсодержащие вещества (типичными представителями являются глюкоза и (NH4)2SO4. Часто к таким средам добавляют буферные растворы и хелатирующие соединения. Ауксотрофные организмы растут на таких средах только при добавлении соответствующих факторов роста. Основное назначение таких питательных сред – изучение особенностей физиологии и метаболизма микроорганизмов, выделение генетических рекомбинантов и т. д.

По назначению среды разделяют на элективныеи дифференциально-диагностические. Элективные среды обеспечивают преимущественное развитие одного или целой физиологической группы микроорганизмов. Например, для преимущественного выделения грамотрицательных бактерий бывает достаточным добавления в питательную среду трифенилметановых красителей (кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый и т. д.). Для выделения стафилоккоков в среду может быть добавлен хлористый натрий в концентрации 7,5 %. При этой концентрации рост других бактерий подавляется. Элективные среды применяются на первом этапе выделения чистой культуры бактерий, т. е. при получении накопительной культуры.

Дифференциально-диагностические среды применяются для быстрой идентификации близкородственных видов микроорганизмов, для определения видовой принадлежности, в клинической бактериологии и др. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохимической активности и имеют неодинаковый набор ферментов, расщепляющих субстраты, входящие в состав питательной среды.

В состав дифференциально-диагностической среды входят:

а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий;

б) определенный химический субстрат, отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроорганизма;

в) цветной индикатор, изменение окраски которого свидетельствует о биохимической реакции и наличии данной ферментной системы у исследуемого микроорганизма.

Например, среда Эндо позволяет отличить клоны, сбраживающие лактозу от клонов, не обладающих этим свойством. Основными компонентами этой среды являются питательный (пептонный) агар, углевод и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом (реактив Шиффа). Исходная питательная среда окрашена в розовый цвет. Микроорганизмы, не сбраживающие лактозу, образуют бесцветные колонии. При сбраживании лактозы до ацетальдегида последний реагирует с сульфитом и развививается красная окраска соответствующих колоний.

Среда с эозином и метиленовым синим (среда Левина) в качестве индикаторов содержит эозин и метиленовый синий и исходно окрашена в черно-синий цвет. Клетки, осуществляющие брожение, образуют колонии, окрашенные в черный с металлическим блеском цвет, а колонии, не обладающие этим свойством, бесцветны. Подобные изменения окраски происходят потому, что красители присутствуют в среде не в виде самостоятельных соединений, а в виде комплексов с веществами питательной среды. При низких значениях рН эти комплексы выпадают в осадок, исходные же красители в этих условиях растворимы, при больших рН комплексы красителей бесцветны, тогда как метиленовый синий приобретает синюю окраску. Данная среда позволяет дифференцировать бактерии рода Escherichia от бактерий рода Proteus.

По консистенции среды могут быть жидкими, полужидкими, твердыми, сыпучими. Жидкие питательные среды получают при растворении в воде определенного необходимого набора питательных веществ, макро- и микроэлементов. По составу они могут быть как натуральными, так и синтетическими. Рост микроорганизмов в жидкой среде может происходить в периодической (закрытой) системе, в этом случае после инокуляции среды не происходит ни добавления, ни удаления каких-либо компонентов, кроме газовой фазы (закрытая система). При проточном (непрерывном) культивировании характерна постоянная подача свежих питательных компонентов со скоростью, равной скорости удаления среды (открытая система).

Среды в твердом состоянии в форме плотных гелей используются в бактериологии со времен Р. Коха. Наиболее важным преимуществом использования твердых сред является то, что на них можно выращивать микроорганизмы в виде колоний, образующихся из отдельных клеток популяции.

Приготовление твердых питательных сред достигается добавлением к жидким средам определенных уплотнителей, в качестве которых могут выступать агар, желатина, силикагель, каррагенан. Наиболее распространенным из уплотнителей является агар – полисахарид, выделяемый из красных морских водорослей и состоящий из двух полисахаридов – агарозы (70 %) и агаропектина. Он обладает рядом полезных свойств, в частности: 1) способен образовывать в воде гели;

2) плавится при температуре 100 °С и затвердевает при 45 °С ; 3) не расщепляется под влиянием ферментов большинства видов микроорганизмов; 4) термолабильные вещества и живые микроорганизмы не разрушаются при добавлении к нагретому до 45 °С расплавленному агару, если смесь сразу же охладить; 5) агаровые гели имеют высокую степень прозрачности; 6) обычно используемые концентрации
1,5 ‑ 2,0 % являются относительно невысокими и их использование экономично.

Желатина – белок, приготовленный из кожи и костей, – в настоящее время используется для специальных целей, поскольку образуемый ею гель плавится при температурах около 25 – 30 °С. Кроме того, желатина разжижается протеолитическими ферментами многих микроорганизмов. «Уплотняющая» концентрация желатины – 17 – 20 %.

Силикагелем называют двуокись кремния (SiO2). Его стерильный золь готовят из раствора силиката натрия и перед использованием, для того чтобы вызвать образование геля, к нему добавляют питательную среду, содержащую электролиты. Среды на основе силикагеля
(1,5 – 2,0 %) используют для получения культур автотрофных бактерий, так как при этом в среде отсутствуют органические вещества. При добавлении в такие минеральные среды различных органических веществ можно исследовать способность гетеротрофных бактерий использовать их в качестве единственных источников углерода. С помощью силикагелиевых сред также можно определять потребности бактерий в витаминах.

Каррагенан («растительная желатина») – добывается путем экстракции из определенных видов красных морских водорослей. Калиевые соли некоторых типов каррагенанов способны образовывать плотные (2 %) прозрачные гели, которые могут быть заменителями агара. Каррагенан значительно дешевле агара, не разрушается большинством видов бактерий. Однако разливать приготовленные среды следует при высокой температуре – 55 – 60 °С.

Полужидкие среды содержат гелеобразующее вещество в низкой (0,3 – 0,7 %) концентрации и имеют мягкую желеподобную консистенцию. Такие среды пригодны для изучения подвижности и хемотаксиса клеток, культивирования микроаэрофилов.

Сыпучиесреды представляют собой массу в той или иной степени измельченного и увлажненного сырья (чаще всего, растительного). Основное их назначение – использование в пищевой промышленности (получение соевого соуса или рисовой водки), сельском хозяйстве (силосование кормов) и т. д.

В бактериологической практике чаще всего используются сухиепитательные среды, которые получают в промышленных масштабах – триптические гидролизаты дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин) и питательный агар. Сухие среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке, имеют относительно стандартный состав.

Классификация питательных сред

Питательные среды классифицируются по происхождению, консистенции, составу, целевому назначению.

А. По происхождению питательные среды делятся на естественные, искусственные, синтетические.

Естественными питательные среды называются в тех случаях, когда для выращивания микроорганизмов используются натуральные продукты (молоко, свернутая сыворотка и др.).

Искусственные питательные среды – это среды, которые готовятся по специальным прописям из различных продуктов, например, мясо-пептонный агар (МПА) или мясо-пептонный бульон (МПБ).

И естественные, и искусственные среды могут быть растительного (картофельная среда) или животного(молочные, мясные среды) происхождения.

Синтетическими питательными средами называются такие, которые состоят из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозировках . Синтетические среды используются, когда выращиваемую бактериальную клеточную массу необходимо освободить от балластных органических соединений, входящих в состав обычных питательных сред.

Например, синтетические среды необходимы при получении бактериальных аллергенов или при изучении метаболических потребностей микроорганизмов. Преимущество таких питательных сред состоит в том, что они легко воспроизводимы, так как имеют постоянный состав.

Б. По консистенции различают питательные среды жидкие, полужидкие и плотные.

Жидкиесреды готовят, используя экстракты, растворы, гидролизаты различных исходных продуктов. Таким образом, вещества, необходимые для питания бактерий, находятся в растворенном состоянии. (Примеры: МПБ, солевой бульон и др.).

Полужидкие среды готовятся на основе жидких с добавлением в их состав 0,2-1% агара-агара или другого уплотнителя. Уплотнители – вещества, придающие средам требуемую консистенцию. В качестве уплотнителя чаще всего используется агар-агар (по-малайски – желе) – это полисахарид — продукт переработки некоторых морских водорослей; он плавится при температуре 80-86оС, а затвердевает при 40оС). Желатина тоже является уплотнителем; она представляет собой экстракт из тканей, содержащих много коллагена (костной или хрящевой). Желатину добавляют в питательные среды в количестве 10-22%. Температура плавления желатины – 25оС, что делает её неудобной для выращивания большинства микроорганизмов; оптимальная температура культивирования которых составляет 37оС.

Кроме того, некоторые бактерии выделяют протеолитические ферменты, разлагающие желатину.

Плотные питательные среды тоже готовятся на основе жидких, но содержащие агар-агара должно быть не менее 1,5-2%. (Примеры: МПА, сахарный агар).

Таким образом, консистенция питательных сред определяется количеством содержащихся в их составе агара-агара.

В. По составу питательные среды могут быть простыми и сложными.

Простыесодержат минимальное количество компонентов (например: МПБ, МПА).

Сложные готовятся путём добавления к простым определённых дополнительных компонентов (крови, сыворотки, глюкозы и др.).

Г. По целевому назначению питательные среды делят на основные, элективно-селективные, дифференциально-диагностические, транспортные.

К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий (примеры МПА, МПБ).

Элективно-селективные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определённого вида (или определённой группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При этом состав сред определяется биологическими особенностями, по которым данный микроорганизм отличается от большинства других. Компоненты таких питательных сред обеспечивают преимущественный рост искомых микроорганизмов и (или) подавление в той или иной степени рост сопутствующей микрофлоры.

По консистенции эти среды могут быть жидкими(например: 1% пептонная вода для выделения холерного вибриона) или твёрдыми (желточно-солевой агар для выделения стафилококков).

Дифференциально-диагностические среды предназначены для разграничения отдельных видов или типов микроорганизмов.

Состав таких питательных сред основан на том, что отдельные виды (или типы) бактерий различаются между собой по биохимической активности вследствие неодинакового набора ферментов.

В состав таких сред входит обычно:

Ÿ питательная основа (МПБ или МПА), обеспечивающая рост изучаемых микроорганизмов;

Ÿ субстат, выявляющий наличие ферментов (например, лактоза, глюкоза);

Ÿ индикатор. Индикаторы – это вещества, меняющие свой цвет в зависимости от рН среды.

Их используют не только для определения кислотности среды, но и вводят в состав питательной среды для выявления биохимических свойств микробов.

Изменение цвета среды указывает на образование кислоты или щёлочи в результате ферментативной деятельности микробов (например: индикатор Андреде в кислой среде имеет красную окраску, при нейтральном значении рН-бесцветную; аналогичным образом действует индикатор фуксин).

Примеры дифференциально-диагностических сред: среда Эндо, позволяющая отличать лактозоположительные и лактозоотрицательные энтеробактерии; жидкая среда Раппопорт, выявляющая различия тифозных и паратифозных бактерий и многие другие.

Выделяют транспортные среды (консервирующие), которые используются для первичного посева и транспортировки исследуемого материала. Они предотвращают отмирание патогенных микроорганизмов и способствуют подавлению сапрофитов. К этой группе относятся: глицериновая смесь, глицериновый консервант с солями лития и др.

Приведённая классификация в большой степени условна, так как некоторые среды могут быть одновременно и дифференциально-диагностическими, и селективными (например, среда Плоскирева, ЖСА и другие).

В настоящее время в лабораторной практике часто используются сухие питательные среды, которые выпускаются в виде полуфабрикатов. Для их производства используется рентабельное непищевое сырьё, отходы мясной и рыбной промышленности. Применение сухих сред избавляет лаборатории от трудоёмкого процесса приготовления обычных сред, позволяет получать сопоставимые результаты в разных лабораториях и приближает к разрешению вопроса о стандартизации питательных сред. Технология приготовления таких сред проста, она указана на этикетке. Сухие питательные среды удобны в транспортировке и хранении.

Питательные среды и методы выделения чистых культур

Для культивирования бактерий используют питательные среды, к которым предъявляется ряд требований.

1. Питательность. Бактерии должны содержать все необходимые питательные вещества.

2. Изотоничность. Бактерии должны содержать набор солей для поддержания осмотического давления, определенную концентрацию хлорида натрия.

3. Оптимальный рН (кислотность) среды. Кислотность среды обеспечивает функционирование ферментов бактерий; для большинства бактерий составляет 7,2–7,6.

4. Оптимальный электронный потенциал, свидетельствующий о содержании в среде растворенного кислорода. Он должен быть высоким для аэробов и низким для анаэробов.

5. Прозрачность (чтобы был виден рост бактерий, особенно для жидких сред).

6. Стерильность.

Классификация питательных сред.

1. По происхождению:

1) естественные (молоко, желатин, картофель и др.);

2) искусственные – среды, приготовленные из специально подготовленных природных компонентов (пептона, аминопептида, дрожжевого экстракта и т. п.);

3) синтетические – среды известного состава, приготовленные из химически чистых неорганических и органических соединений.

2. По составу:

1) простые – мясопептонный агар, мясопептонный бульон;

2) сложные – это простые с добавлением дополнительного питательного компонента (кровяного, шоколадного агара): сахарный бульон, желчный бульон, сывороточный агар, желточно-солевой агар, среда Китта—Тароцци.

3. По консистенции:

1) твердые (содержат 3–5 % агар-агара);

2) полужидкие (0,15—0,7 % агар-агара);

3) жидкие (не содержат агар-агара).

4. По назначению:

1) общего назначения – для культивирования большинства бактерий (мясопептонный агар, мясопептонный бульон, кровяной агар);

2) специального назначения:

а) элективные – среды, на которых растут бактерии только одного вида (рода), а род других подавляется (щелочной бульон, 1 %-ная пептонная вода, желточно-солевой агар, казеиново-угольный агар и др.);

б) дифференциально-диагностические – среды, на которых рост одних видов бактерий отличается от роста других видов по тем или иным свойствам, чаще биохимическим (среда Эндо, Левина, Гиса, Плоскирева и др.);

в) среды обогащения – среды, в которых происходит размножение и накопление бактерий-возбудителей какого-либо рода или вида (селенитовый бульон).

Для получения чистой культуры необходимо владеть методами выделения чистых культур:

1. Механическое разобщение (метод штриха обжигом петли, метод разведений в агаре, распределение по поверхности твердой питательной среды шпателем, метод Дригальского).

2. Использование элективных питательных сред.

Колония – это видимое невооруженным глазом, изолированное скопление бактерий на твердой питательной среде.

ОСНОВНЫЕ ТИПЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

По составу питательные среды принято делить на естествен­ные (или натуральные) и синтетические.

Натуральными (естественными) обычно называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения. Основой таких сред являются овощные и фрук­товые соки, молоко, животные ткани (мясо, рыба, печень и др.), разведенная кровь, отвары или экстракты, полученные из при­родных субстратов, таких как мясо, солод, картофель, почва, дрожжи и др. На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, поскольку они содержат все компо­ненты, необходимые для роста и развития. Натуральные среды используются главным образом для поддержания культур мик­роорганизмов и накопления биомассы. Однако эти среды име­ют сложный, неопределенный химический состав и мало при­годны для изучения обмена веществ микроорганизмов.

К числу натуральных сред, широко применяемых в лабора­торной практике, относятся мясо-пептонный бульон (МПБ), неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельные среды, почвенный экстракт.

Синтетическими называют среды, в состав которых входят только определенные химически чистые соединения, взятые в точно указанных количествах. Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонен­тов, можно изучить их потребление и превращение в соответ­ствующие продукты обмена.

В настоящее время в распоряжении микробиологов имеется достаточное количество синтетических сред, не уступающих по своим качествам сложным натуральным средам.

Полу синтетические среды также относятся к средам неопре­деленного состава. Их главными составными частями являются известные соединения (углеводы, соли аммония, нитраты, фос­фаты и т. д.), а компонент неопределенного состава (кукуруз­ный экстракт, дрожжевой автолизат, гидролизат казеина и др.) содержится в относительно низких концентрациях. Такие среды находят особенно широкое применение в биотехнологии амино­кислот, витаминов, антибиотиков и др.

По назначению различают элективные и дифференциально-диагностические среды.

Элективные среды предназначены для выделения чистых культур микроорганизмов из среды их естественного обитания (воды, почвы, пищевых продуктов и т. п.).

Дифференциально-диагностические среды — это такие сре­ды, с помощью которых можно довольно быстро отличить (дифференцировать) одни виды микроорганизмов от других. Их состав подбирается с таким расчетом, чтобы можно было четко выявить наиболее характерные свойства данного вида. Примером такой среды для выявления кишечной палочки в ес­тественных субстратах (воде, пищевых продуктах) может слу­жить среда Эндо. Кишечная палочка образует на этой среде малиновые колонии с металлическим блеском. Дифференциаль­но-диагностические среды особенно широко применяются в са­нитарной и медицинской микробиологии для быстрого ориен­тировочного определения отдельных групп микроорганизмов.

Питательные среды бывают жидкие, плотные и сыпучие. Основой жидких сред является вода. К ним относятся отвары и экстракты (натуральные среды) или растворы химических веществ и других компонентов (синтетические и полусинтети­ческие среды).

Плотные среды получаются путем прибавления к жидким средам желатина или агар-агара (вещество, добываемое из морских водорослей, содержит главным образом полисахари­ды). Недостатком желатина является низкая температура плавления (24—27 °С), а агар-агар плавится при 100 °С и за­стывает при 40—45 °С. При развитии в жидкой среде культуры микроорганизмов образуют суспензии, осадок или пленку, ори развитии на плотной среде — колонии.

Агаризованные питательные среды находят чрезвычайно ши­рокое применение в микробиологической практике. Они исполь­зуются: для изучения характера роста и классификации микро­организмов; для количественного учета микроорганизмов; для выделения чистых культур микроорганизмов при микробиоло­гическом анализе воздуха, воды, почвы и т. д.; для пересылки культур микроорганизмов на расстояние, например культура дрожжей на заводы высылается на сусловом агаре; для дли­тельного хранения культур. Плотные питательные среды обла­дают еще тем преимуществом, что загрязнение культур извне на жидкой среде в большинстве случаев бывает незаметно,

а на плотной это сразу заметно, так как инородная культура развивается в самостоятельную, хорошо отличимую невоору­женным глазом колонию.

Сыпучие среды, например отруби, применяют для культи­вирования некоторых микроорганизмов в производстве биоло­гически активных веществ ;(ферментных препаратов).

Рецептура основных питательных сред приводится в руко­водствах к лабораторным занятиям.

Дата добавления: 2015-11-20; просмотров: 2150;

Питательные среды

Питательные среды — это искусственно приготовленный комплекс питательных веществ, предназначенный для культивирования микроорганизмов. Это искусственно приготовленная среда обитания микробов. Такие питательные среды обычно готовят на определенной основе (агар, мясо-пептонный бульон и пр.), с учетом пищевых потребностей культивируемых на них микробов. Они бывают простого и сложного состава и готовятся для лабораторных или промышленных целей.

Питательные среды должны:

1. Содержать в нужном количестве весь набор элементов, которые предназначены для восполнения структуры микроорганизмов. Они должны быть в усвояемых химических соединениях:многоатомные спирты, углеводы, органические кислоты и пр. — это источники углерода; аммонийные соединения, аминокислоты, белки, пептиды — источники азота;соли фосфорной и др. кислот — источники микроэлементов;витамины и др.

— факторы роста,а также должны содержать соли, воду.

2. Иметь оптимальную: влажность (не мене 20 % воды), вязкость, рН среды (диапазон от 4,5 до 8,5), изотоничность (для большинства — 0,85 %, для голофилов — 3 %), окислительно-восстановительный потенциал Rh (для анаэробов 0,120-0,060, для аэробов более 0,90).

3. Питательная среда должна быть прозрачной.

4. Питательная среда должна быть стерильной.

Питательные среды по консистенции могут быть жидкие и полужидкие (0,3-0,7 % агара) и плотные (1,5-2,0 % агара).

Для приготовления питательных сред применяют естественные продукты животного, яичного, рыбного и растительного происхождения или искусственные ингредиенты в строго определенных количествах и такие среды называют синтетическими, а при добавлении к ним еще и естественных продуктов — полусинтетическими. Питательные среды из естественных продуктов имеют неопределенный химический состав и требуют добавок некоторых веществ — ингибиторов посторонней флоры и пр. В состав питательных сред на синтетической основе входят аминокислоты, витамины, минеральные соли и др. известные химические элементы в известных количествах. В полусинтетические среды кроме известных элементов входят пептон, дрожжевой экстракт и др. вещества.

Питательные среды по назначению бывают: консервирующие, обогащения, элективно-диагностические, универсальные и дифференциально-диагностические.

Консервирующие или транспортные среды предназначены для транспортировки в баклабораторию материала первично засеянного у постели больного.

Универсальные среды предназначены для роста неприхотливых микробов или добавки таких сред как основы к более сложным.

Среды обогащения предназначены для накопления одних микробов при подавлении роста других, что бывает очень важным, т.к. первичный материал часто засевают на твердые среды и обогащения одновременно.

Элективно-диагностические среды предназначены для первичного выделения групп или родов микроорганизма с целью последующей дифференцировки и идентификации на других средах.

Дифференциально-диагностические среды предназначены для окончательного ответа о виде и подвиде выделенной чистой культуры.

Элективность диагностических сред выделения бактерий достигается за счет добавления в их состав определенных ингибиторов для других видов микроорганизмов (желчь, азид натрия, теллурит калия, рН, соль, антибиотики и др. вещества). Проводимая далее с чистой культурой дифференциальная диагностика бактерий основана на определении особенностей, например, биохимических и др., путем внесения в среду определенных субстратов (сорбита, мальтозы, сахарозы и др. — это углеводы; орнитина, лизина, аргинина и др. – это белки; солей, мочевины и пр.).

В настоящее время на разные группы микробов выпускают в стране и за рубежом тесты нескольких поколений и порядков: 1-порядка — тест-система, расфасованная по лункам полистироловых пластин питательная среда (АР1-20E, Eneroes, MMТE1 и др.). 2-порядка — системы в бумажном индикаторном исполнении (Micro-10, M:N:ТEK и др.), 3 -порядка — тест-система жидкая, приготовленная ex тempore.

Приготовление питательных сред

Ввиду множества прописей приготовления питательных сред, в этом разделе приводим примеры приготовления наиболее распространенных из питательных сред.

Компоненты для питательных сред. Натуральные питательные среды целиком состоят из животного сырья (свернутая сыворотка, кровь и др.) или с наполнителем (агар, пептон, желатин и др.). Для питательных сред используют:картофель,кровь, молоко, яйца, рыбную муку, дрожжи и пр. и готовят из них экстракты и настои (полуфабрикаты, гидролизаты и перевары, например, Хоттингера) и пр. Это источники белковых, азотистых и др. веществ. В качестве минеральных солей используют:NaCI, KHPO4, MgSO4 и др. В качестве сахара – глюкозу либо лактозу, мальтозу, сахарозу и пр. Из индикаторов применяют Андреде (0,5 г кислый фуксин, 1N NaOH 17 мл, дистиллированная вода до 100 мл), Кларка (1,5 % раствора фенолового красного, метиленового красного, бромтимолового синего и др.), а также нужно использовать аминокислоты, витамины и др. ингредиенты.

Для искусственных сред применяют определенные элементы в строго известных дозах, которые оптимальны для конкретных микроорганизмов.

Некоторые рецепты приготовления питательных сред:

Транспортные среды.

1. Среда с теллуритом калия. Агаровую основу 0,1 % разливают в пробирки по 4 мл. Стерилизуют при 1 атм 20 мин. В каждую пробирку по правилам асептики вносят 0,5-1,0 мл сыворотки КРС и по 0,05 мл 2 % раствора теллурита калия. Срок хранения 10 дней.

2. Среда Тига (глицериновая смесь). Смешивают 1 л глицерина и 2 л 0,85 % раствора хлорида натрия и 15-20 % раствора фосфата натрия в количестве, чтобы рН был 7,8-8,0. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд или 20 мин при 0,5 атм.

3. Глицериновый консервант. Это разновидность глицериновой смеси, с содержанием солей лития.

Среды обогащения.

1. Селенитовая среда. Смешивают пептон- 0,5 г, селенистокислого натрия — 0,4 г, фосфата натрия однозамещенного — 0,7 г, фосфорнокислого двузамещенного натрия — 0,7 г, лактозы — 0,4 г, дистиллированной воды — до 100 мл. Разливают по пробиркам и флаконам, стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.

2. Среда Мюллера. В стерильные флаконы отвешивают 4,5 г мела, стерилизуют сухим жаром, наливают 90 мл бульона и стерилизуют 30 мин при 1 атм. К каждому флакону в асептических условиях добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора гупосульфита натрия.

Раствор Люголя:дистиллированная вода 20 мл, йодида калия 20 г, йода 25 г. После растворения доливают дистиллированной воды до 100 мл.

Раствор гипосульфита натрия:в мерный цилиндр насыпают 50 г гипосульфита натрия и добавляют дистиллированной воды до 100 мл, перемешивают, переливают в бутыль, стерилизуют текучим паром.

Универсальные среды.

1. Мясо-пептонный бульон.

а) Приготовление мясного экстракта:

500 г мяса (без костей, жира и сухожилий) разрезают на мелкие кусочки (пропускают через мясорубку), заливают 1 л водопроводной воды. Выдерживают сутки в холодильнике или 2 ч в термостате при 370 С. Отжимают мясо через марлю, кипятят на огне 5 мин и дают остыть. Фильтруют через ватный фильтр, доливают водой до первоначального объема

б). Приготовление мясопептонного бульона:

В 1 л мясной воды растворяют при подогревании и помешивании 10 г (1 %) пептона и 5 г (0,5 %) поваренной соли. Устанавливают слабощелочную реакцию 10 % раствором соды с помощью лакмуса (красная лакмусовая бумага слегка синеет). Кипятят 30-40 мин на огне. Дают остыть, фильтруют через бумажный фильтр и доливают водой до первоначального объема. Определяют концентрацию водородных ионов калориметрическим путем — в компараторах, подправляют рН 10 % раствором щелочи или уксусной кислоты. Кипятят, остужают, фильтруют, разливают по 5-6 мл в пробирки и по 50-100 мл в колбы, стерилизуют до 20 мин в автоклаве при 120о С.

2. Приготовление мясопептонного агара:

К бульону прибавляют 2- 3 % измельченного агара, нагревают до растворения агара, остужают агар до 500 С. Для осветления вносят белок 1 куриного яйца, смешивают его с двойным объемом холодной воды и вносят в агар, автоклавируют 45 мин при 1150 С для осаждения хлопьев белка. Фильтруют агар еще не остывший, разливают в стеклянную посуду. Вновь стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1200 С. Готовят скошенный или прямой агар, остужая пробирки (флаконы, колбы) до застывания агара.

3. Приготовление перевара (гидролизат) Хоттингера:

а) Мясо (1 кг) нарезают кусочками, добавляют двойной объем воды и кипятят 15-20 мин, извлекают, пропускают через мясорубку и опускают снова в тот же бульон, подщелочив его до рН 8,0. Охлаждают до 400 С, добавляют поджелудочную железу, пропущенную через мясорубку, в объем 100 г на 1 л воды.

б) Фарш перемешивают, подщелачивают, переливают в бутыль с плотной резиновой пробкой, оставляют треть бутылки свободной. Вносят 1-3 % хлороформа, закрывают бутыль, встряхивают, открывают бутыль на 1 мин для выпускания хлороформа

в) Проверяют рН (через 1 ч после добавления фермента) и подщелачивают до рН 7,4-7,6. Смесь оставляют на 10-16 дней при комнатной температуре. Первые дни подщелачивают и встряхивают. За несколько дней до окончания экспозиции бутыль не встряхивать.

г) Правильный перевар будет иметь пылевидный осадок и соломенно-желтый раствор. Содержание азота 11,00-12,00 г на 1 л. Перевар фильтруют через полотнянный фильтр или бумажный, разливают в бутыли и колбы и стерилизуют в течение 30 мин при 1200 С.

4. Приготовление бульона Хоттингера:

К 100 мл перевара Хоттингера добавляют 800 мл дистиллированной воды, вносят 5 г хлористого натрия, 0,2 г однозамещенного фосфорнокислого натрия, устанавливают рН 7,4-7,6. Разливают в колбы и пробирки. Стерилизуют в течение 20 мин при 1200 С. Содержание аминного азота — 1,00-1,20 г на 1 л.

5.Приготовление агара Хоттингера:

К 1 л бульона Хоттингера в колбе объемом 2-3- л прибавляют 18-25 г мелко нарезанного агара (1,5-2,0 %). Будьон кипятят, постоянно его перемешивая, до расплавления агара. Устанавливают рН 7,4-7,6 . Расплавленный агар фильтруют через несколько слоев марли и разливают в колбы и пробирки. Посуду расставляют в специальную тару и стерилизуют в течение 20 мин при 1200 С в стерилизаторе. Затем стерильный агар в посуде используют для посева микроорганизмов или расплавляют, разливают в более мелкую посуду и вновь стерилизуют.

Элективно-диагностические среды.

1.Пептонная вода:

В воду добавляют 1 % пептона (1 г на 100 мл воды), устанавливают рН 8,0, разливают по 15 мл в пробирки, стерилизуют 20 мин при 1200 С. Среда предназначена для роста холерных вибрионов, при ингибиции остальных бактерий.

Рекомендуемые страницы:


Добавить комментарий

Закрыть меню